Development of novel osteogenic stimulators regulating BMP and Wnt pathway
- 발행기관 이화여자대학교 대학원
- 지도교수 황은숙
- 심사위원 권영주
- 심사위원 민용기
- 심사위원 우현애
- 심사위원 홍정호
- 발행년도 2018
- 학위수여년월 2018. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 대학원 약학과
- 원문페이지 x, 91 p.
- URI http://www.dcollection.net/handler/ewha/000000147383
- 본문언어 영어
- 저작권 이화여자대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Osteoporosis is characterized by low bone mineral density and an increased fracture risk. Development of bone forming medicines is essential for treating osteoporosis. Since runt-related transcription factor 2 (RUNX2) plays a crucial role in bone formation, the present study aimed to search for small molecules that induce RUNX2 activity and obtained two novel compounds, DMP-PYT (5Z)-5-((E)-3-(4-(dimethylamino)phenyl)allylidene)-1-(3,5-dimethylphenyl)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione and IBIP (3-(2,3-dimethoxyphenyl)-1-[9-methyl-2-phenyl-9H-imidazo[1,2-a]benzimidazol-3-yl]-2-propen-1-one). DMP-PYT strongly promoted RUNX2 transcription activity and accelerated osteoblast differentiation through activation of BMP2-dependent SMADs. β-catenin, a Wnt signaling molecule was also significantly activated by DMP-PYT. Furthermore, more importantly, DMP-PYT advanced bone formation during zebrafish larvae development. The second novel compound, IBIP also increased RUNX2 activity and stimulated osteogenic gene expression and calcium accumulation in C2C12 and MC3T3-E1 cells. IBIP potentiated BMP2 signaling pathway through activation of SMAD and ERK/mitogen-activated protein kinase. In addition, IBIP administration resulted in enhanced skeletal development and ossification of zebrafish larvae in vivo. These results suggest that novel small molecules, DMP-PYT and IBIP may have beneficial effects for treating bone loss including osteoporosis.
more초록/요약
골다공증은 고령 여성에게 빈번하게 나타나는 질환이다. 이를 치료하기 위해 사용되었던 bisphosphnaste 계열의 파골세포억제제 등은 부작용이 크다. 이를 개선하기 위해 새로운 개념의 골다공증 치료제 개발이 필요하다. 때문에 조골세포를 활성화하여 파골세포와의 균형을 유지할 수 있는 약물을 발굴하고자 하였다. 이 연구에서는 조골세포가 분화 될 때 중요한 key factor 인 RUNX2를 활성화 시키는 small molecules 을 발굴하고자 luciferase assay를 스크리닝 시스템으로 도입하였다. 1차와 2차 스크리닝을 통해 RUNX2의 전사를 활성화 시키는 약물을 골라냈다. 이들 중에 RUNX2 상위 시그널인 BMP2활성화에 따른 SMAD 1/5/8 인산화, Wnt 시그널링 활성화에 따른 β-catenin의 단백질 양을 증가 시키는 약물을 찾았다. 다음으로 ALP staining 과 ALP activity 실험을 수행하여, 조골세포의 분화능을 증가 시키는 4종을 중 신규성이 있는 DMP-PYT 와 IBIP 두 약물이 최종 candidates로 선택되었다. 첫 번째 약물인 DMP-PYT는 BMP와 Wnt 시그널과 관련된 extracellular signaling 인자들을 활성화 시킴으로써 RUNX2를 비롯한 하위 인자들의 증가 유도한다는 것을 Western blotting 과 Real time PCR 분석 방법으로 확인하였다. BMP2 시그널에 대한 선택적 억제제인 LDN-193189의 도입을 통해 DMP-PYT 가 유도한 조골세포에 대한 분화조절능력이 BMP2 시그널의 활성화를 통한 것임을 알게 되었다. 우리는 조골전구세포주인 MC3T3-E1 분화유도를 유도하여 ALP staining 과 Alizarin red S staining을 통해 확인하였다. 특히 DMP-PYT는 In vivo zebra fish larvae의 골형성을 촉진에도 뛰어난 능력을 가진 다는 것을 calcein staining 을 통해서 증명하였다. 두 번째 약물인 IBIP는 BMP2을 통한 SMADs 의 활성화뿐만 아니라 MAPK/ERK 활성화 시킨다는 것을 western blot 을 통해 알게 되었다. 이들 시그널에 대한 선택적 억제제 하에서는 조골세포 분화력이 감소하였다. SMAD1/5/8과 ERK 의 인산화 증가에 따른 RUNX2 전사활성 증가는 ALP, osterix 와 같은 하위 인자의 유전자 발현에 영향을 주었다. 이 약물에 의한 조골전구세포와 zebra fish larvae이 조골세포 분화도 관찰되었다. 결과적으로, 우리는 RUNX2를 타겟으로 한 스크리닝 을 통해 발굴 한 DMP-PYT와 IBIP가 효과적으로 조골세포분화에 증가시킨다는 것을 In vitro와 In vivo 시스템에서 증명하였다. 이들 약물이 새로운 기전을 이용한 골다공증 치료제로서의 가능성이 있음을 보고한다.
more목차
IV. INTRODUCTION 1
A. Major signaling pathways involved in osteogenesis 2
B. Significance of BMP and Wnt signaling crosstalk in bone 5
C. Regulation of RUNX2 activity 6
D. Specific plans for osteogenic small molecule screening 6
V. MATERIALS AND METHODS 9
A. Reagents 9
B. Cell culture 9
C. Cell cytotoxicity assay 10
D. Osteogenic differentiation 10
E. ALP and Alizarin red S staining and ALP activity analysis 11
F. Transfection and Reporter gene assay 11
G. Immunofluorescence analysis 12
H. Western blot analysis 12
I. Revers transcription and quantitative real time PCR 13
J. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay 14
K. Zebra fish model and calcein staining 15
L. Statistical analysis 16
VI. Results 17
A. A novel osteogenic stimulator, DMP-PYT 17
1. Screening of RUNX2-activating small molecules 17
2. Selection of osteogenic lead compounds, MP-PYT (No. 26) and IBIP (No. 27) 20
3. Identification of osteogenic activator, DMP-PYT 24
4. Promotion of osteoblast differentiation by DMP-PYT 28
5. Increased BMP and WNT signaling by DMP-PYT 34
6. Activation of Wnt signaling by DMP-PYT 38
7. Cooperation of BMP and WNT signaling by DMP-PYT 41
8. Acceleration of bone formation by DMP-PYT in vivo 43
B. A novel osteogenic stimulator, imidazobenzimidazole derivative, IBIP 48
1. Identification of osteogenic activator, IBIP 48
2. Induced osteoblast differentiation by IBIP 51
3. Increased BMP2 and ERK signaling by IBIP 56
4. Significance of IBIP-induced BMP2 and ERK activation 56
5. Promotion of osteoblast differentiation by IBIP in vivo 61
VII. DISCUSSION 64
VIII. REFERENCE 68
Appendix 88
Abstract (in Korean) 90
