Development of RSV Vaccine Candidates Using RSV G and RSV M2 Proteins
- 발행기관 이화여자대학교 대학원
- 지도교수 장준
- 발행년도 2018
- 학위수여년월 2018. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 대학원 약학과
- 원문페이지 viii, 121 p.
- URI http://www.dcollection.net/handler/ewha/000000148095
- 본문언어 영어
- 저작권 이화여자대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
호흡기세포융합바이러스 (Respiratory syncytial virus; RSV)는 영유아와 노인층, 면역력이 저하된 환자에게서 상하부 호흡기 질환을 일으키는 대표적인 호흡기 바이러스이다. 하지만 인플루엔자와는 다르게 아직까지 허가된 백신은 없고, 현재 RSV의 F 융합 단백질에 특이적인 단클론항체로 구성된 Palivizumab(Synagis)이 사용되고 있다. RSV는 10개의 유전자와 11개의 바이러스 단백질로 이루어져 있다. 표면에는 F, G, 그리고 SH 단백질이 발현되어 있고, 내부는 NS1, NS2, N, P, M, M2-1, M2-2, 그리고 L 단백질로 구성되어 있다. 이 중에서 RSV G 당단백질의 염기 서열 변이와 단클론항체의 인식 패턴에 따라 RSV는 A와 B의 두 가지 아형으로 분류되며, RSV 에 대한 중화항체반응을 유도할 수 있다고 알려져 있다. RSV M2는 하나의 유전자에서 2개의 ORF(Open reading frame)에 따라 M2-1과 M2-2 의 2개의 단백질이 만들어지는데, M2-1에 있는 아미노산 82-90 부분은 CD8 T 세포 에피토프(epitope)을 가지고 있어 RSV에 특이적인 CD8 T 세포반응을 유도할 수 있다. 본 학위논문에서는 표면 단백질 중 하나인 RSV G단백질을 이용한 항체 매개 백신후보물질과 RSV M2단백질을 이용한 T 세포 기반 백신후보물질을 각각 서로 다른 플랫폼으로 제작하여 RSV 감염에 대한 방어능을 조사하였다. 첫 번째로, RSV A와 RSV B 아형에서 RSV G 단백질 131-230 아미노산 서열 부분을 포함하는 단편을 얻어 유전적으로 연결하였고, 박테리아에서 발현 및 정제를 통해 융합 단백질인 GcfAB를 제작하였다. 이를 점막경로인 비강과 설하를 통해 2회 면역화 한 후, RSV A와 B 타입 감염에 대한 각각의 방어능을 확인하였다. 면역화 된 마우스에서 얻은 혈청에서 RSV A와 B의 G 단백질에 특이적인 IgG 항체와 IgA 항체 반응이 높게 유도되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 G 특이적인 CD4 T 세포 반응이 유도되는 것도 확인하였다. 특히, 접종 경로와 서로 다른 RSV 아형의 감염에 따라 유도되는 면역 반응의 정도가 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 비록 Th17 경향의 CD4 T 세포 반응에 의한 면역병리현상이 나타났지만, RSV A 와 B 서브타입에 대해서 모두 훌륭한 방어능을 보여주었다. 두 번째로 RSV M2 단백질을 이용한 재조합 백큘로바이러스 백신을 제작하여 RSV 에 대한 방어능을 확인하였다. 이는 백큘로바이러스 벡터를 기반으로 한 백신물질로, 사람에 대한 낮은 독성과 pre-existing 면역 반응이 없다는 장점이 있어 최근 각광받고 있는 시스템이다. 본 연구에서는 백큘로바이러스에 RSV M2 단백질을 발현시킨 Bac_RSVM2 백신물질을 근육 내 투여를 통해 RSV 특이적인 CD8 T 세포 반응을 priming 한 후, RSV 감염 시 유도되는 면역반응을 조사하였다. 그 결과, Bac_RSVM2는 마우스 내에서 효과적으로 RSV M2 특이적인 CD8 T 세포를 유도하였고, 또한 유도된 CD8 T 세포들이 바이러스 제거에 있어 중요한 역할을 한다고 알려져 있는 인터페론 감마를 유도하는 것도 확인하였다. 특히 백신물질에 의한 면역병리현상 없이 바이러스 복제능력을 약화시키는 결과를 보여줌으로써, 이를 통해 T 세포 기반 RSV 백신도 충분히 가능성이 있음을 확인하였다. 종합적으로, RSV에 대한 항체반응을 유도하는 RSV G 단백질과 CD8 T 세포반응을 유도하는 M2 단백질을 각각 서로 다른 플랫폼에 발현시킨 RSV 백신 후보 물질은 RSV 감염에 대해서 훌륭한 방어면역반응을 유도할 수 있다는 것을 보고함으로써 RSV에 대한 효과적인 백신물질의 가능성을 제시한다.
more초록/요약
Respiratory syncytial virus (RSV) is a major cause of acute lower respiratory tract infection in infants, young children, and the elderly. Two subtypes of RSV, A and B, circulate alternately at 1-2-year intervals during epidemics. RSV infection in infants and young children is a serious problem because it can lead to pulmonary dysfunction and asthma later in life. Thus, it is necessary to develop an RSV vaccine which can counteract both RSV subtype infections. However, despite efforts to develop vaccines, none have been shown to be safe and effective. Here, this thesis introduces an antibody-mediated subunit vaccine, GcfAB, consisting of RSV G proteins derived from RSV A2 and B1 strains (part A), and a T-cell based vaccine expressing RSV M2 protein using baculovirus expression platform (part B). First vaccine candidate is recombinant fusion protein, GcfAB, which consists of the central regions (a.a. residues 131-230) of the G proteins of both RSV A2 and B1 strains. The GcfAB plus cholera toxin (CT; mucosal adjuvant) immune-mice via intranasal (IN) or sublingual (SL) routes induced high levels of RSV G-specific serum IgG and mucosal IgA antibody responses in both RSV subtype infections. In particular, the RSV G-specific CD4+ T-cell response to RSV A subtype was more strongly induced than those of RSV B subtype. Although the SL immunization showed more vigorous RSV G-specific CD4+ T-cell response and vaccine-enhanced immunopathology than did the IN immunization after RSV A challenge but not RSV B challenge, GcfAB provided completely protection against both RSV subtype infections. Second vaccine candidate is recombinant baculovirus-based vaccine expressing the M2 protein, Bac_RSVM2, which was constructed by Bac-to-Bac expression system with pFastBac1-vector containing the RSV M2 gene under the control of Cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter to induce CD8+ T-cell responses in mammalian host. Baculovirus has attracted attention as a vaccine vector due to its ability to induce a high level of humoral and cellular immunity, low cytotoxicity against various antigens, and biological safety for humans. This vaccine showed that immunization with Bac_RSVM2 via IN or intramuscular (IM) routes effectively elicited the RSV M2-specific IFN-γ producing CD8+ T-cell responses. Most notably, immunization with Bac_RSVM2 almost completely suppressed RSV replication in the lung without vaccine-enhanced immunopathology such as body weight loss or pulmonary cell infiltration. Together, these results suggest that GcfAB and Bac_RSVM2 could be novel RSV vaccine regimens preventing RSV subtype infections.
more목차
Ⅰ. INTRODUCTION 3
A. RSV G protein as an antibody-mediated RSV vaccine candidate 8
1) Role of RSV G protein for RSV vaccine development 8
2) Previous studies using Gcf-based vaccine candidates 8
3) Introduction of GcfAB as a novel RSV vaccine candidate 9
B. RSV M2 protein as a T-cell based RSV vaccine candidate 13
1) Role of RSV M2 protein for RSV vaccine development 13
2) CD8+ T-cell responses of RSV M2 protein against RSV infection 13
3) Baculovirus as a vectored vaccine 14
4) Introduction of Bac_RSVM2 as a novel RSV vaccine candidate 15
Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 17
1. Mice and ethics statement 17
2. Construction and purification of a recombinant fusion protein consisting of G core fragments from the RSV A and B subtypes 17
3. Generation of recombinant baculovirus expressing RSV M2 protein 19
4. Cell lines and preparations of RSV and recombinant baculovirus 20
1) Cell line and preparation of RSV 20
2) Cell line and preparation of recombinant baculovirus 21
5. Immunization and RSV challenge in mice 22
1) Experimental procedures related to Part A 22
2) Experimental procedures related to Part B 23
6. Sample preparation 23
1) Preparation of mouse serum 24
2) Preparation of bronchoalveolar lavage (BAL) fluids and cells 24
3) Preparation of lung cells and supernatants 24
7. ELISA 24
1) Measurement of serum IgG and mucosal IgA antibody responses 24
2) Measurement of epitope-specific serum IgG antibody responses 25
8. Flow cytometric analysis 26
1) Flow cytometric analysis of BAL cells 26
2) Tetramer assay 26
3) Intracellular cytokine staining assay 27
9. Virus titration in the lung 28
10. Histology 28
11. Statistical analysis 29
Ⅲ. RESULTS 30
Part A. Universal Vaccine against Respiratory Syncytial Virus A and B Subtypes 30
1. Construction and purification of the GcfAB subunit vaccine 30
2. Humoral antibody responses are induced in GcfAB-immune mice against both RSV subtypes 33
3. B cell epitope-specific serum IgG antibody responses are induced differently in GcfAB immunization depending on the administration routes 40
4. RSV A-specific CD4+ T-cell responses are induced in GcfAB-immune mice after RSV A2 challenge 45
5. Immunization with GcfAB does not induce RSV B-specific CD4+ T-cell responses after RSV B subtype challenge 50
6. GcfAB immunization can protect against both RSV A and B subtype infections 55
7. Vaccine-induced pulmonary cell infiltration in GcfAB-immune mice is promoted after both RSV A subtype challenge, but not RSV B subtype 58
8. GcfAB immunization induces vaccine-enhanced diseases in mice after RSV A subtype challenge, but not RSV B subtype challenge 67
Part B. Protective CD8+ T-cell Immune Responses Induced by Recombinant Baculovirus Expressing Respiratory Syncytial Virus (RSV) M2 Protein against RSV Infection 72
1. Generation of recombinant baculovirus-based RSV M2 vaccine and experimental design 72
2. RSV M2-specific CD8+ T-cell responses are induced in mice immunized with Bac_RSVM2 75
3. RSV M282-90-specific IFN-γ-producing CD8+ T cells are boosted in Bac_RSVM2-immune mice after RSV challenge 79
4. Bac_RSVM2 does confer protective efficacy against RSV infection 83
5. Bac_RSVM2 vaccine does not promote vaccine-enhanced immuno-pathology following RSV infection 85
Ⅳ. DISCUSSION 90
1. GcfAB vaccine study 90
2. Bac_RSVM2 vaccine study 95
REFERENCES 99
국문 초록 115
저자 논문 리스트 118
감사의 글 119
