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Porcine single cell culture methodology for cell lineage tracing by somatic mutation to understand early pig embryogenesis

돼지 조직의 단일 세포 배양 방법 가이드 : 체세포 돌연변이를 이용한 세포 계통추적을 하기 위한 수단인 돼지 단일 세포 배양 방법론

  • 홍주희 (Hong, Joo-hee, 경북대학교 대학원 의과학과)

초록/요약

배경 : 모든 생명체는 정자와 난자가 수정된 하나의 공통조상인 수정란에서 발생한다. 수정 후 많은 세포 분열을 거쳐 30조 개 이상의 세포를 가진 개체로 발달하게 된다. 이는 매우 복잡한 과정으로 윤리적, 기술적 문제로 대부분 탐구되지 않은 상태로 남아있었다. 그러나 Single cell clonal expansion이라는 기술을 이용하여, monoclonal population을 획득하여 WGS을 진행하고, 이를 통해 mutaion을 역추적해 retrospective lineage tracing을 진행한다면 수정체부터 개체까지의 발생 초기 여정을 재구성 할 수 있다. 방법 : 본연구에서 돼지로부터 근육조직 204개, 피부조직 204개, 장기 168개의 조직을 떼어내 실험을 진행했다. 얻은 조직을 이용해 일차 세포 배양을 진행하여 단일 세포를 증식, 배양시켜 단일 세포 유래의 클론을 획득한다. 결과 : 돼지 1마리에게서, 576군데의 source를 얻어 일차 세포 배양을 진행했고, 해당 source를 이용하여 117번의 single cell cloning이 진행되었다. 이를 통해 49군데의 해부학적 위치에서 단일 세포 유래의 클론을 획득하였으며, 122개의 source에서 총 485개의 단일 세포 유래의 클론을 획득하였다. 결론 : 본 연구를 통해 얻은 클론이 단일 세포 유래라는 것을 확인하기 위하여 VAF 값을 확인해보았다. 해당하는 클론의 VAF값이 0.5에 가까운 peak 값을 보여주었고, 이는 단일 세포 유래라는 것을 의미한다. 따라서 본 실험을 통해 얻은 단일 세포 유래의 클론은 lineage tracing에 이용할 수 있음이 확인되었다.

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목차

Ⅰ. Introduction 1
Ⅱ. Materials & Methods 5
1. Materials 5
1.1. Animals
1.2. Equipments
1.3. Reagents
1.4 Reagent preparation
2. Cell culture 8
2.1. Dissection
2.2. Primary culture
2.3. Cell passage
2.4. Single cell cloning & expansion
3. Immunocytochemistry 11
4. Timelapse 12
5. Data analysis and statistical processing 13
Ⅲ. Results 14
1. The location of the collected tissue
2. Primary culture success rate
3. The probability of getting a clone for each source
4. Would the clones be collected well if they grew up in passage 1
5. Are the cells that grow well in the early days more likely to collect clones
6. Comparison of single cell culture results with or without bFGF
7. Variant allele frequency (VAF) 0.5 value = single cell clone
8. Lineage of 14 cells
Ⅳ. Discussion 19
Ⅴ. Figures and Figure legends 20
References 34
국문 초록 37

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