c-kit을 타깃하는 인간 2G4 항체에 대한 항-약물 항체의 제작 및 특성 분석
Generation and Characterization of Anti-Drug Antibody against Human 2G4 Antibody, Targeting c-kit
- 주제(키워드) h2G4 , c-kit , CD117 , ADA , monoclonal antibody , characterization , antibody therapy
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 박상규
- 발행년도 2020
- 학위수여년월 2020. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 약학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000030100
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Anti-drug antibody (ADA)는 체내에서 약물을 항원으로 인식하여 생성된 anti body를 말하며, 약물의 반복적인 투여로 인해 생성된다고 보고되어 있다. ADA는 환자에게 처방된 약물과 타깃의 결합을 억제하기 때문에 치료 효과가 감소한다. c-kit은 티로신 인산화 효소 수용체 (Receptor tyrosine kinase, RTK)로 세포내 신호 전달 경로와 관련이 있다. 줄기세포 성장 인자 (Stem cell factor, SCF) 수용 체인 c-kit은 주로 세포 분화와 혈관 신생 등을 유발하여 종양 발생을 유도한다. 이러한 이유로 c-kit의 신호 전달 경로는 항암 치료에 있어 중요한 포인트이며, 암의 증식과 생존을 효과적으로 억제할 수 있는 방법으로 c-kit의 신호 전달 경 로를 차단하는 연구가 활발히 진행 중이다. h2G4 IgG는 본 연구실에서 개발된 인간 단클론 anti-c-kit antibody로, c-kit이 주요 인자로 작용하는 암의 antibody 치료제로써 개발 중이다. 본 연구의 목적은 환자 혈청 내 h2G4 IgG의 존재 하에 서 면역 체계에 의한 anti-h2G4 antibody의 생성 유무를 확인할 수 있도록 표준 물질로서 anti-h2G4 antibody를 개발하는 것이며, 이렇게 개발된 antibody는 anti -h2G4 antibody의 생성 정도를 측정할 수 있는 기준점을 제공할 수 있다. 본 실험에서는 생쥐의 면역화를 통해 anti-h2G4(Fab) antibody를 제작하였으 며, competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)로 h2G4 IgG 중화 antibody를 선별하였다. Limiting dilution을 통해 단클론 h2G4 IgG 중화 antibody 를 확보하였고, antibody 동정을 위한 epitope binning을 통해 단클론 M2-4F2-4E9-1A2, M4-3F2-2D12을 선별하였다. 선별된 단클론 h2G4 IgG 중화 antibody 의 FACS 실험 결과, h2G4 IgG 중화 antibody는 h2G4 IgG와 c-kit의 결합을 감소 시켜 h2G4 IgG에 의한 SCF와 c-kit의 결합 차단 효과를 억제하였다. FACS와 western blot 실험을 통해 단클론 h2G4 IgG 중화 antibody는 세포에 비특이적 결합이 없음을 확인하였으며, h2G4 IgG 에 의한 c-kit의 세포내 신호 전달의 억제가 h2G4 IgG 중화 antibody에 의해 해소된 것을 확인하였고, p-c-kit의 level 변화를 통해 h2G4 IgG와 특이적으로 결합하여 중화하는 것을 확인하였다. 또 한 단클론 h2G4 IgG 중화 antibody는 p-Erk와 p-Akt의 변화에 영향이 없음을 확 인하였고, c-kit의 세포내 신호 전달과 무관함을 검증하였다. 따라서 M2-4F2-4E9-1A2와 M4-3F2-2D12는 h2G4 IgG만을 중화하는 anti-h2G4-idiotype antibody 임을 입증하였다. h2G4 IgG에 대해 특이적인 M2-4F2-4E9-1A2와 M4-3F2-2D12는 단백질 공학 등을 통해 인간화하여 h2G4 IgG 에 대한 ADA 생성 여부를 판단하는 기준점을 제공할 수 있다.
more초록/요약
Anti-drug antibody (ADA) refers to antibodies generated inside the body when a drug is recognized as an antigen and it is reported to be produced following repeated administration of the drug. ADA inhibits the binding of the drug prescribed for a patient to its target, so it reduces the treatment efficiency. c-kit, a receptor tyrosine kinase (RTK), is associated with an intracellular signal transduction pathway. c-kit is a stem cell factor (SCF) receptor that induces tumor formation by typically inducing cell division and angiogenesis. Due to these functions, c-kit’s signal transduction pathway is a critical target for anticancer therapy, and research on inhibition of this signal transduction pathway to effectively suppress cancer growth and proliferation is actively in progress. h2G4 IgG is a human monoclonal anti-c-kit antibody developed by my laboratory as an antibody drug for a cancer that uses c-kit as a main driver. The goal of this research is to develop an anti-h2G4 antibody as a reference material that could verify production of anti-h2G4 antibody in a patient in the presence of h2G4 IgG within the patient’s serum. These developed antibodies could provide a reference point for measuring the production level of anti-h2G4 antibodies within patients. In this study, anti-h2G4(Fab) antibodies were generated by the immunization of mice to h2G4 antibodies, and h2G4 IgG neutralizing antibodies were screened for using competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Monoclonal h2G4 IgG neutralizing antibodies were acquired using limiting dilution. For antibody identification, epitope binning was used to screen for monoclonal M2-4F2-4E9-1A2 and M4-3F2-2D12. According to fluorescence-activated cell sorting (FACS) results of the isolated monoclonal h2G4 IgG neutralizing antibody, h2G4 IgG neutralizing antibodies reduce the binding of h2G4 IgG to c-kit and prevent the inhibition of SCF binding to c-kit. By FACS and Western blot, we verified that monoclonal h2G4 IgG neutralizing antibodies do not have non-specific binding within the cell and that the inhibition of c-kit’s intracellular signal transduction was reduced due to h2G4 IgG neutralizing antibody. We confirmed that the changes in p-c-kit’s level lead to neutralization through specific binding with h2G4 IgG. Also, we verified that monoclonal h2G4 IgG neutralizing antibodies have no effect on changes in p-Erk and p-Akt, and that M2- 4F2-4E9-1A2 and M4-3F2-2D12 are anti-h2G4-idiotype antibodies that neutralize only h2G4 IgG. M2- 4F2-4E9-1A2 and M4-3F2-2D12, specific to h2G4 IgG, could provide a reference material for determining the internal production of ADA against h2G4 after they are humanized through protein engineering.
more목차
Ⅰ. 서론 1
Ⅱ. 재료 및 방법 12
1. 생쥐의 면역화를 통한 anti-h2G4 antibody 생산 12
2. 세포배양 12
3. Myeloma cell과 B cell의 융합 13
4. 효소 면역 분석법(ELISA) 14
5. Limiting dilution 을 이용한 단클론 antibody cloning 17
6. h2G4 IgG 중화 antibody의 정제 17
7. h2G4 IgG 중화 antibody의 biotinylation 18
8. h2G4 IgG 중화 antibody의 epitope binning 18
9. 유세포 분석 (FACS) 19
10. Western blot 20
11. Anti-h2G4-idiotype antibody의 isotype 확인 21
Ⅲ. 결과 23
1. 생쥐의 면역화와 antibody 생성 23
2. 세포 융합과 anti-h2G4(Fab) antibody 생산 hybridoma의 선별 23
3. h2G4 IgG 중화 antibody의 선별 24
4. 단클론 antibody screening 24
5. 단클론 h2G4 IgG 중화 antibody의 정제 25
6. 단클론 h2G4 IgG 중화 antibody의 epitope binning 26
7. FACS를 이용한 단클론 h2G4 IgG 중화 antibody의 중화능 검증 27
8. Western blot을 이용한 단클론 h2G4 IgG 중화 antibody의 중화능 검증 27
9. 단클론 anti-h2G4-idiotype antibody의 cross-reactivity 분석 28
10. 단클론 anti-h2G4-idiotype antibody의 isotype 확인 28
Ⅳ. 고찰 51
Ⅴ. 결론 54
Ⅵ. 참고문헌 56
